Cele projektu

• Głównym celem projektu jest opracowanie nowych i oryginalnych metod optycznych oraz oprzyrządowania do badań funkcjonalnych narządu wzroku ludzi i zwierząt z wykorzystaniem procesów absorpcji dwufotonowej i fluorescencji wzbudzonej dwufotonowo.
• Ogólna koncepcja jest ukierunkowana na opracowanie nowych metod obrazowania, które pozwolą na istotną zmianę paradygmatu optycznych technik diagnostycznych in vivo. Jako główny cel naszych badań wybraliśmy tylny odcinek ludzkiego oka - zwłaszcza optycznie niejednorodny i bogaty we fluorofory nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) oraz fotoreceptory.
• Głównym celem projektu jest poszerzenie wiedzy na temat właściwości optycznych siatkówki i jej podatności na nieliniowe procesy optyczne. W szczególności zwrócimy uwagę na dwa zjawiska: dwufotonową izomeryzację chromoforów rodopsyny oraz dwufotonową fluorescencję wzbudzoną komórek RPE.

Planowane efekty

• Wprowadzenie obiektywnych pomiarów procesu absorpcji za pomocą spektroskopii z sondą pompową w wyekstrahowanej rodopsynie oraz w ludzkich oczach in vivo.
• Wprowadzenie efektywnego dostarczania światła do siatkówki i poprawa czułości detekcji w celu uzyskania obrazowania fluorescencji wzbudzonej dwufotonowo przy ekspozycjach osiągających dopuszczalne limity bezpieczeństwa dla ludzi (tylko eksperymenty na zwierzętach).
• Opracowanie kompaktowych i mocnych wytrzymałych źródeł światła o centralnej długości fali 1050 nm i czasie trwania impulsu około 30 fs, stosowanych do badań dwu-fotonowej absorpcji w siatkówce.

Program TEAM TECH

Projekt POIR.04.04.00-00-3D47/16 jest realizowany w ramach programu TEAM TECH Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego ze środków UE pochodzących z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Inteligentny Rozwój

Zrealizowane cele naukowe projektu

• Cel projektu dotyczący budowy urządzenia pozwalającego na detekcję zmian w siatkówce w odpowiedzi na stymulację został zrealizowany. Zdecydowaliśmy się na zastosowanie pełnopolowej OCT jako platformy eksperymentalnej do opracowania metody czynnościowego badania fotorecpetorów. Podejście to daje znacznie lepszą czułość i niezawodność, ponieważ monitoruje fazę mierzonego sygnału zamiast modulacji intensywności. Pokazaliśmy, że system ten jest w stanie mierzyć zmiany występujące w siatkówce w odpowiedzi na pobudzanie pojedynczym impulsem światła, jak i pobudzanie migotaniem.
• Cel projektu dotyczący budowy lasera femtosekundowego do zastosowania w dwufotonowej mikroperymetrii został zrealizowany. Osiągnięto następujące parametry: zakres przestrajania długości fali 872 nm – 1075 nm, energia impulsu w zakresie 13.2–24.1 pJ, moc średnia 0.68–1.24 mW przy częstotliwości powtarzania impulsów 51.5 MHz. Laser generuje impulsu o czasie trwania około 230 fs w całym zakresie przestrajania. Opracowane źródło laserowe pozwoliło na badanie krzywej czułości widzenia dwufotonowego w zakresie emisji źródła laserowego.
• Kolejnym ze zrealizowanych celów naukowych była budowa stanowiska pomiarowego umożliwiającego obrazowanie gryzoni (myszy). W opracowanym systemie, aby zwiększyć intensywność fluorescencji dwufotonowej i zmniejszyć wymaganą moc lasera, modulowaliśmy ultrakrótkie impulsy laserowe z kompensacją dyspersji wysokiego rzędu, zastosowaliśmy bezczujnikową optykę adaptywną i własne oprogramowanie do odzyskiwania obrazu. Podejście takie pozwoliło na zaobserwowanie ponad 300% wzrost fluorescencji endogennych fluoroforów siatkówki.
• Następnym ze zrealizowanych zadań było przeprowadzenie pomiarów na myszach. W naszych badaniach uzyskaliśmy molekularną identyfikację, lokalizację i kwantyfikację składników komórkowych oka w oparciu o zwiększoną wydajność generowania fluorescencji TPE z wewnętrznych fluoroforów siatkówki przy użyciu zaawansowanych metod przetwarzania sygnału fluorescencyjnego. Zmierzyliśmy zanik fluorescencji i dane spektralne, aby nieinwazyjnie odróżnić i zróżnicować zapasy witaminy A i złogi produktów ubocznych cyklu retinoidalnego w rozdzielczości subkomórkowej w oczach myszy i jak wpływają na nie manipulacje genetyczne, aby odtworzyć warunki związane z chorobami ślepoty u ludzi. W celu uwidocznienia produktów kondensacji siatkówki w nabłonku pigmentowym siatkówki (RPE), badaliśmy myszy Abca4PV/PVRdh8-/-, u których wcześniej stwierdzono akumulację A2E. Uzyskaliśmy obrazy FLIM używając światła 850 nm, ponieważ nie oczekiwano wzbudzenia przy tej długości fali dla estrów retinylu.
• Cel projektu dotyczący opracowania kolejnego lasera femtosekundowego do zastosowania w dwufotonowo wzbudzanym fluorescencyjnym obrazowaniu dna oka ludzkiego został zrealizowany. Opracowany kompaktowy, łatwy w obsłudze laser światłowodowy wraz z elektroniką sterującą. Laser generuje impulsy o czasie trwania 60 fs i środkowej długości fali 780 nm. Energia impulsu wynosi 1.3 nJ, a częstotliwość powtarzania impulsów może być regulowana w zakresie od 1 do 12 MHz.

Najważniejsze aspekty nowatorskie

• Pierwszym z takich aspektów było opracowanie laboratoryjnej wersji lasera femtosekundowego do mikroperymetrii dwufotonowej. Opracowany kompaktowy, światłowodowy, stabilny środowiskowo oscylator wytwarza wysokiej jakości impulsy femtosekundowe. Dzięki tej konstrukcji obniżona zostanie cena przyszłych mikroperymetrów. Wyniki prac opublikowane zostały w czasopismach Photonics Research oraz Biomedical Optics Express.
• Drugim z takich aspektów było opracowanie nowej metody obrazowania opartej na Fd-FF-OCT umożliwiającej obrazowanie in vivo siatkówki ludzkiej bez przesłuchów. W zwykłych systemach obrazowania siatkówki Fd-FF-OCT nie ma mechanicznego otworu konfokalnego na drodze detekcji. Ten brak powoduje, że część światła, które jest koherentne z odniesieniem, ale ulega wielokrotnemu rozproszeniu w tkance, może również zniekształcać obrazy poprzez artefakty koherentne. W naszym systemie zaproponowaliśmy nowe podejście do redukcji przesłuchu, które zostało osiągnięte poprzez zastosowanie szybkiej, deformowalnej membrany (DM), która niszczy koherencję przestrzenną lasera strojonego. Wyniki prac opublikowane zostały w czasopiśmie o wysokim współczynniku IF – Optica.
• Opracowaliśmy także kompaktowy i prosty system do efektywnego badania widzenia dwufotonowego. System został oparty na femtosekundowym laserze światłowodowym z domieszką Er, który jest przesunięty spektralnie i podwojony częstotliwościowo, co zapewnia szeroki spektralny zakres działania około 200 nm. Czas trwania impulsu sub-230 fs, niemal stały w całym spektralnym zakresie strojenia, umożliwił wiarygodne i bezpieczne pomiary widzenia dwufotonowego. Opracowany system pozwolił nam opisać krzywą luminacji skotopowej dla widzenia dwu fotonowego dla 3 zdrowych osób. Ponadto, nasz system laserowy może być doskonałym i unikalnym narzędziem do diagnozowania patologii oka lub do monitorowania leczenia. Średnia moc wyjściowa systemu była w pełni wystarczająca i bezpieczna dla przedstawionych pomiarów w ludzkim oku. Wyniki prac opublikowane zostały w czasopiśmie Biomedical Optics Express.

Najważniejsze aspekty rezultatów stanowiących innowacje

• Porównaliśmy impulsy laserowe 75-fs, 32-fs i 20-fs do obrazowania obszarów siatkówki większych niż 1x1 mm u myszy z dobrze zdefiniowanymi defektami genetycznymi, które powodują degeneracyjne choroby siatkówki u ludzi. Średnia fluorescencja z RPE modeli mysich ludzi przy zastosowaniu impulsów laserowych 20-fs była około 3 razy większa niż mierzona przy zastosowaniu impulsów laserowych 75-fs o tej samej mocy średniej i długości fali centralnej. Ponadto, przy użyciu zróżnicowanego zestawu pomiarów strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych nie wykryliśmy żadnych zmian w strukturze ani funkcjonalności siatkówki po obrazowaniu TPEF. Wyniki te zostały opublikowane w czasopiśmie o wysokim IF - JCI Insight i stanowią istotny postęp w kierunku osiągnięcia bezpiecznego obrazowania TPEF podstawowych zdarzeń biochemicznych przyczyniających się do widzenia i zdrowia ludzkiego oka.
• Pomiary TPEF na precyzyjnie dobranych genetycznie zmodyfikowanych osobnikach myszy pozwoliły nam skupić się na znalezieniu w obrazach niektórych typowych wskaźników chorób ludzkiego oka, w tym lokalnych stężeń niepożądanych lub szkodliwych produktów ubocznych biochemicznego procesu widzenia. Bazując na doświadczeniach zdobytych w tych eksperymentach byliśmy w stanie wycelować w niezmodyfikowane osobniki i również w nich obrazować obecność tych substancji. Przeprowadziliśmy wyrafinowaną numeryczną analizę krzyżową surowych obrazów, obejmującą czasowo-rozdzielczą ewolucję fluorescencji, a także dekompozycję spektralną, która potwierdziła identyfikację jednostek chemicznych znalezionych w naszych danych. Wyniki te zostały opublikowane w prestiżowym czasopiśmie PNAS.
• Opracowaliśmy metodę pomiaru odpowiedzi fotoreceptorów na migotanie w warunkach adaptacji do światła. Wykazaliśmy, że możemy wykryć statystycznie istotne różnice w amplitudzie modulacji długości drogi optycznej fotoreceptorów w odpowiedzi na różne częstotliwości migotania, a także zademonstrowaliśmy zdolność do przestrzennego mapowania takiej odpowiedzi na wzorzysty bodziec z paskami światła migoczącymi z różnymi częstotliwościami. Opracowanie metody pomiaru Zaproponowaliśmy także zastosowanie bodźca o zmiennej częstotliwości w pomiarach z migotaniem. Takie podejście pozwala na szybsze uzyskanie charakterystyki częstotliwościowej fotoreceptorów poprzez zmniejszenie liczby wymaganych pomiarów i czasu analizy danych. Prace te mogą w przyszłości doprowadzić do rozwoju innych nowatorskich metod wczesnego wykrywania degeneracji siatkówki i monitorowania terapii. Część z wyników została już opublikowana w czasopiśmie Biomedical Optics Express.